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產(chǎn)品名	活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA)
別名
英文名	Reactive Oxygen Species Assay Kit
CAS號	2044-85-1
分子式	C24H14O7Cl2
分子量	485.26976
EINECS編號
MDL號

	產(chǎn)品名稱	包裝
A 液	DCFH-DA（10mM）	0.1mL
B 液	活性氧陽性對照（Rosup, 50mg/mL）	1mL

使用說明：
1. 裝載探針
對于刺激時間較短（通常為2小時以內(nèi)）的細胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長（通常為6小時以上）的細胞，先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。
原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細胞。按照1∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。去除細胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1mL。37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ毎?0～30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
收集細胞后裝載探針：按照1∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為一百萬至二千萬/mL，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3～5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，或把細胞等分成若干份后刺激細胞。通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ毎?0～30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
說明：僅在陽性對照孔中加入Rosup作為陽性對照，其余孔不必加入Rosup。
2. 檢測
對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細胞儀檢測。對于收集細胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。
3. 參數(shù)設(shè)置
使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCF。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。
                  
4. 其它說明
陽性對照可以按照1∶1000的比例使用。例如裝載好探針的細胞共1mL，可以加入1μL的陽性對照刺激。通常刺激后20­～30分鐘內(nèi)可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對于

不同的細胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可以適當(dāng)提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可以適當(dāng)降低活性氧陽性對照的濃度。
另外，對于某些細胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1∶2000～1∶5000稀釋DCFH-DA，使裝載探針時DCFH-DA的濃度為2～5μmol/L。探針裝載的時間也可以根據(jù)情況在15～60分鐘內(nèi)適當(dāng)進行調(diào)整。
活性氧陽性對照（Rosup）僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入活性氧陽性對照。
保存條件：
-20℃避光保存，有效期一年。
注意事項：
1.  探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背景較高。
2.  探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認探針的裝載情況是否良好。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜請參考上圖。
3.  盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。
4.  為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。